在NGS文库构建工作流中,通常会涉及到文库纯以及片段筛选过程;最重要的步骤之一是在超声打断后去除过大和过小的核酸片段,只保留尺寸适中的片段用于文库构建,此过程称为片段筛选;对扩增后的体系进行离子、dNTP、引物及聚合酶等物质的去除,称为产物纯化,二者皆为磁珠在NGS平台极其重要的应用。
PCR产物纯化原理
应用案例—— MP1-Select 磁珠用于NGS建库片段筛选
首先,对样本进行左侧筛选,获得纯化后的大片段核酸分子;然后,对样本进行右侧筛选,去除大片段核酸分子中过大的部分,只保留中间的部分。两次加入的磁珠与样本体积比参考下图,注意左侧筛选加入的磁珠体积一定大于右侧筛选加入的。筛选结果如下:
注意事项:
为保证片段筛选的效果,用于筛选的片段化核酸分子应满足以下要求:
样本应为片段化的双链核酸分子,片段大小范围应在150bp至800bp范围内
样本应存储在分子试剂专用水或Tris缓冲液或Tris-EDTA缓冲液中,体积应≥50μL
当样本进行左侧筛选(留大去小)时,样本片段最好主要分布于筛选点的右侧
当进行右侧筛选(留小去大)时,样本片段最好主要分布于筛选点的左侧
当进行双侧筛选时,样本片段最好主要分布在以筛选点为中心的两侧